蛋白質(zhì)含量測定方法一般來說,有以下五種:凱氏定氮法,雙縮尿法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)、紫外吸收法和考馬斯亮藍法(Bradford法)。
表五種蛋白質(zhì)含量測定方法的比較
方法 | 靈敏度 | 時間 | 原理 | 干擾物質(zhì) | 說明 |
凱氏定氮法 (Kjedahl法) | 靈敏度低,適用于0.2~ 1.0mg氮,誤差為 ±2% | 費時 8~10小時 | 將蛋白氮轉化為氨,用酸吸收后滴定 | 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離) | 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定;干擾少;費時太長 |
雙縮脲法(Biuret法) | 靈敏度低 1~20mg | 中速 20~30分鐘 | 多肽鍵+堿性Cu2+®紫色絡合物 | 硫酸銨; Tris緩沖液; 某些氨基酸 | 用于快速測定,但不太靈敏;不同蛋白質(zhì)顯色相似 |
紫外吸收法 | 較為靈敏 50~100mg | 快速 5~10分鐘 | 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 | 各種嘌吟和嘧啶; 各種核苷酸 | 用于層析柱流出液的檢測;核酸的吸收可以校正 |
Folin-酚試劑法(Lowry法) | 靈敏度高 ~5mg | 慢速 40~60 分鐘 | 雙縮脲反應;磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 | 硫酸銨; Tris緩沖液; 甘氨酸; 各種硫醇 | 耗費時間長;操作要嚴格計時; 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
考馬斯亮藍法(Bradford法) | 靈敏度zui高 1~5mg | 快速 5~15分鐘 | 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結合時,其lmax由465nm變?yōu)?95nm | 強堿性緩沖液; TritonX-100; SDS | 的方法; 干擾物質(zhì)少; 顏色穩(wěn)定; 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 |
從以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特點和優(yōu)勢,如紫外吸收法測定時間快。但是綜合起來,zui后一種考馬斯亮藍法(Bradford法)效率zui高,無論是測定時間,靈敏度還是受干擾程度,都是比較占優(yōu)勢的。
下面,我們來重點介紹一下其中一種蛋白質(zhì)含量測定方法--凱氏定氮法。
凱氏定氮法(Kjedahl法)
首先將濃硫酸倒入樣品中,邊倒邊搖晃,以使?jié)饬蛩崤c樣品充分接觸,然后加熱試劑。如果你需要加快實驗進度,可以加入CuSO4作催化劑,這樣,實驗的反應時間就會大大縮短。CH2COOH和H2SO4反應生成氨氣,然后氨氣又與H2SO4發(fā)生作用,固定了氮元素。這時我們得到了(NH4)2SO4的溶液,然后我們可以用NaOH去跟硫酸銨反應,通過計算NaOH的使用量,就可以計算出氮的含量。下面是整個定氮法中發(fā)生的化學反應。
CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
當我們得到氮的含量以后,我們就可以通過一定的計算,zui終算出蛋白質(zhì)的含量。
凱氏定氮法常用于有機化合物中的氮含量的測定,是蛋白質(zhì)含量測定的經(jīng)典方法,雖然在測試過程中,試劑用量很大,但是,不可否認,它所適用的樣品范圍之廣,測試結果之,都是*的。
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